এমপিএক্সভি পিসিআর মুনকিপক্স ভাইরাস ফ্রিজ-শুষ্ক মাল্টিপ্লেক্স রিয়েল-টাইম পিসিআর সনাক্তকরণ

অপারেশন পদ্ধতি

১) নিউক্লিক অ্যাসিড নিষ্কাশন: উপযুক্ত নিষ্কাশন কিট ব্যবহার করে নমুনা থেকে ডিএনএ বের করুন। নিষ্কাশনের চূড়ান্ত ধাপে প্রায় 100 μl এল্যুশন বাফার (TE বা নিউক্লিয়েজ-মুক্ত H2O) দিয়ে নিউক্লিক অ্যাসিডকে এলুট করার পরামর্শ দেওয়া হয়। বিশুদ্ধ নিউক্লিক অ্যাসিড অবিলম্বে ব্যবহার করা উচিত বা -20°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করতে হবে।

২) পজিটিভ কন্ট্রোল প্রস্তুতি: পজিটিভ কন্ট্রোল রিহাইড্রেশনের আগে ঘরের তাপমাত্রায় 12 মাস পর্যন্ত সংরক্ষণ করা যেতে পারে। এটি ব্যবহারের আগে 250 μl টিই বাফার বা নিউক্লিয়েজ-মুক্ত H2O যোগ করে, কম গতিতে 15-20 সেকেন্ড ধরে vortex করে এবং কম গতিতে 15-20 সেকেন্ডের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করে রিহাইড্রেশন করতে হবে। অবিলম্বে ব্যবহার করুন বা -20°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করুন।

৩) রিয়েল-টাইম RT-PCR মিক্স প্রস্তুতি

ক) ভ্যাকুয়াম প্যাকেজটি খুলুন এবং রিএজেন্টযুক্ত 8-টিউব স্ট্রিপগুলি বের করুন। টিউবের নীচে পেললেট আছে কিনা তা পরীক্ষা করুন (প্রয়োজনে টিউবের সংখ্যা কাটুন)। যদি সরবরাহকৃত টিউবগুলি আপনার যন্ত্রের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ না হয়, তবে রিএজেন্ট পেললেটটি আপনার যন্ত্রের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ একটি অপটিক্যাল টিউবে স্থানান্তর করুন।

খ) টিউবগুলি খুলুন এবং ক্যাপ(গুলি) ফেলে দিন (রিয়েল-টাইম পিসিআর মেশিনের জন্য উপযুক্ত নয়), এবং নীচের মতো বরফের উপর বিক্রিয়া মিশ্রণ প্রস্তুত করুন

* নেগেটিভ কন্ট্রোল হিসাবে নিউক্লিয়েজ-মুক্ত জল ব্যবহার করা যেতে পারে।

গ) অপটিক্যাল ক্যাপ বা অপটিক্যাল সিল ফিল্ম (সরবরাহ করা হয়নি) দিয়ে টিউবগুলি সিল করুন।

ঘ) কম গতিতে 10~15 সেকেন্ডের জন্য টিউবগুলি ঘোরান এবং 3000rpm-এ 20 সেকেন্ডের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করুন এবং সেগুলিকে একটি রিয়েল-টাইম পিসিআর যন্ত্রে রাখুন।

৩) RT-PCR সেটআপ: বিক্রিয়ার ভলিউম 25μl হিসাবে সেট করুন এবং নীচের হিসাবে পিসিআর অ্যামপ্লিফিকেশন পদ্ধতি সেট করুন। 60°C তাপমাত্রায় FAM (N জিনের জন্য), HEX (E জিনের জন্য), ROX (Orf1ab-এর জন্য) এবং CY5 (RNase P জিনের জন্য) ফ্লুরোসেন্স সংগ্রহ করুন এবং প্যাসিভ রেফারেন্স হিসাবে NONE নির্বাচন করুন।
৪) ফলাফল বিশ্লেষণ এবং ব্যাখ্যা: যন্ত্রের নির্দেশাবলী অনুসারে থ্রেশহোল্ড লাইন সেট করুন।

ক) গুণমান নিয়ন্ত্রণ:

খ) নমুনার ফলাফলের ব্যাখ্যা

প্রযুক্তিগত পরামিতি: