এমপিএক্সভি পিসিআর মুনকিপক্স ভাইরাস ফ্রিজ-শুষ্ক মাল্টিপ্লেক্স রিয়েল-টাইম পিসিআর সনাক্তকরণ

অপারেশন পদ্ধতি

1) নিউক্লিক এসিড এক্সট্রাকশন সঠিক এক্সট্রাকশন কিট ব্যবহার করে নমুনা থেকে ডিএনএ এক্সট্রাক্ট করুন।এটি সুপারিশ করা হয় যে নিউক্লিক অ্যাসিডটি এক্সট্রাকশনের চূড়ান্ত ধাপে প্রায় 100 μl এলুশন বাফার (TE বা নিউক্লিয়াস মুক্ত H2O) দিয়ে এলুটেড হয়বিশুদ্ধ নিউক্লিক অ্যাসিড অবিলম্বে ব্যবহার করা উচিত অথবা -২০°C এ সংরক্ষণ করা উচিত।

2) পজিটিভ কন্ট্রোল প্রস্তুতি পজিটিভ কন্ট্রোলটি রিহাইড্রেশন করার আগে 12 মাসের জন্য পরিবেষ্টিত তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা যেতে পারে।এটি ব্যবহারের আগে 250 μl টিই বাফার বা নিউক্লিয়াস মুক্ত H2O যোগ করে পুনরায় জলীয় করা উচিতঅবিলম্বে ব্যবহার করুন অথবা -২০°C এ সংরক্ষণ করুন।

3) রিয়েল-টাইম আরটি-পিসিআর মিশ্রণ প্রস্তুতি

A) ভ্যাকুয়াম প্যাকেজটি খুলুন এবং রিএজেন্ট ধারণকারী 8 টি টিউব স্ট্রিপগুলি বের করুন। পিলেটটি টিউবের নীচে রয়েছে তা পরীক্ষা করুন (প্রয়োজন হলে টিউবগুলির সংখ্যা অনুসারে কাটা) ।যদি সরবরাহিত টিউব আপনার যন্ত্রের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ না হয়আপনার যন্ত্রের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ একটি অপটিক্যাল টিউবে রিএজেন্ট পেললেটটি স্থানান্তর করুন।

খ) টিউবগুলি খুলুন এবং ক্যাপগুলি (রিয়েল-টাইম পিসিআর মেশিনগুলির জন্য উপযুক্ত নয়) ফেলে দিন এবং নীচের মতো বরফে প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি প্রস্তুত করুন

* নিউক্লিয়াস মুক্ত পানি নেগেটিভ কন্ট্রোল হিসেবে ব্যবহার করা যেতে পারে।

গ) টিউবগুলিকে অপটিক্যাল ক্যাপ বা 96-পুল প্লেট দিয়ে অপটিক্যাল সিলিং ফিল্ম দিয়ে সিল করুন (সরবরাহ করা হয়নি) ।

D) 10 ~ 15 সেকেন্ডের জন্য কম গতিতে টিউবগুলিকে ঘূর্ণায়মান করুন এবং 3000rpm এ 20 সেকেন্ডের জন্য সেন্ট্রিফুগ করুন এবং এগুলিকে রিয়েল-টাইম পিসিআর যন্ত্রের মধ্যে রাখুন।

3) আরটি-পিসিআর সেটআপঃ প্রতিক্রিয়া ভলিউম 25μl হিসাবে সেট করুন, এবং পিসিআর পরিবর্ধন পদ্ধতি নীচের মত। FAM (এন জিনের জন্য), HEX (ই জিনের জন্য),ROX (Orf1ab এর জন্য) এবং CY5 (RNase P জিনের জন্য) ফ্লুরোসেন্স 60°C এ, এবং প্যাসিভ রেফারেন্স হিসেবে NONE নির্বাচন করুন।
4) ফলাফল বিশ্লেষণ এবং ব্যাখ্যা যন্ত্রের নির্দেশাবলী অনুযায়ী থ্রেশহোল্ড লাইন সেট করুন।

ক) গুণমান নিয়ন্ত্রণ:

B) নমুনা ফলাফলের ব্যাখ্যা

টেকনিক্যাল প্যারামিটারঃ